文献紹介ナショナルバイオリソースプロジェクト「メダカ」

Reference No.	R10122
Title	The National BioResource Project Medaka (NBRP Medaka): an integrated bioresource for biological and biomedical sciences.
Authors	Sasado T, Tanaka M, Kobayashi K, Sato T, Sakaizumi M, Naruse K.
Journal	Exp Anim. 2010;59(1):13-23.
PMID	20224166

目的

メダカはモデル脊椎動物の研究対象としての基盤が日本で確立され、発生生物学、遺伝学、毒物学、進化学など多くの研究分野で利用されています。基礎生物学研究所の成瀬らが中心になって、ナショナルバイオリソースプロジェクト「メダカ」が実施されました。本論文はこのプロジェクトの紹介を行うもので、さまざまな系統のメダカや遺伝子材料など各種リソースの概要説明がなされています。リソースの具体的な内容は、ホームページ「NBRP Medaka」に記載されています。

遺伝子データベース

このプロジェクトで作成された遺伝子データベースには、ベクターキャッピング法で作製したメダカの11組織（ステージ22の胚、ステージ35の胚、稚魚、雄肝臓、雌肝臓、脳、鰓、腎臓、脾臓、精巣、卵巣）の完全長cDNAライブラリーが記載されており、これらのライブラリーから単離した約25万クローンの5’端塩基配列と3’端塩基配列並びに15,381個の完全長cDNAクローンの全長配列が登録されています。これだけのデータがあれば、遺伝子の構造や発現プロフィール解析を行い、メダカのトランスクリプトーム解析に関する論文が書けると思いますが、現時点でなぜか論文化されていません。「生命科学系データベースアーカイブ　Medaka Full-length cDNA Database」によると塩基配列解析を実施したのは、国立遺伝研の小原らのグループです。他にも多くの解析を手掛けており、論文作成まで手が回らなかったのでしょうか。

評価

ここではホームページ「NBRP Medaka」から入手できる完全長cDNAクローンの塩基配列情報をもとに、ライブラリーの品質の評価を行ってみます。対象として長鎖遺伝子に焦点を絞りました。全長配列を決めた完全長cDNAクローンリストには、cDNAの鎖長の記載がなく、ホモロジー検索結果のスコアのみなので、スコアの大きい上位100クローンについてクローン名をもとに「Medaka Full-length cDNA Database」を検索し、cDNAの鎖長を調べました。

7kbp以上の鎖長の完全長cDNAクローンリストを表1に示します。Definitionは、cDNAの配列を用いてNCBIのデータベースをBLAST検索し、ヒットした遺伝子の名前です。5’-Insertはゲノム配列にない余分に付加している塩基で、ゲノム配列にあるGから始まるものはgと記しました。CGGCCGGCCGATは切残りのベクター配列です。n5’（5’端がGで始まり一部領域が重なる配列を有するクローンの数）とn3’（ポリ(A)が付加している3’端がほぼ同じ配列を有するクローンの数）は両末端部分塩基配列のクラスタリングを行って求められています。従って、n3’は各遺伝子に対応するcDNAの全クローン数、またn5’はその中の完全長cDNAのクローン数に相当します。

表1 長鎖完全長cDNAクローン
No.	Gene symbol	Definition	Clone name	Length	5'-Insert	n5'	n3'
1	-	similar to ankyrin 3	olbrno56_f16	12,985	G	1	2
2	tenm4	teneurin transmembrane protein 4	olbrno4_i08	10,791	G	2	3
3	cacna1e (?)	voltage-dependent R-type calcium channel subunit alpha-1E	olbrno49_a12	10,547	G	1	2
4	lrba	LPS responsive beige-like anchor protein	olecno1_m02	10,471	G	1	4
5	tln2a	talin 2a	olebno18_n14	10,017	G	1	1
6	nf1a	neurofibromin 1a	olbrno63_k23	9,851	G	1	1
7	tanc2	tetratricopeptide repeat, ankyrin repeat and coiled-coil containing 2b	olebno60_j10	9,553	G	1	1
8	kif13ba	kinesin family member 13Ba	olbrno32_e19	9,462	G	1	5
9	ubr5	ubiquitin protein ligase E3 component n-recognin 5	olebno62_m06	9,140	g	1	4
10	abca2	ATP-binding cassette, sub-family A (ABC1), member 2	olebno38_p18	8,724	G	1	1
11	prrc2b	proline-rich coiled-coil 2B	olebno3_b03	8,659	G	2	4
12	agrn	agrin	olecno14_k17	8,627	G	1	6
13	hectd1	HECT domain containing 1	olecno34_c03	8,539	G	1	3
14	flna	filamin A, alpha	olebno32_i01	8,489	G	3	16
15	kif1b	kinesin family member 1B	olebno65_n05	8,413	G	1	2
16	col12a1a	collagen, type XII, alpha 1a	olecno10_p23	8,365	G	2	6
17	igf2r	insulin-like growth factor 2 receptor	olovano13_a12	8,338	g	1	2
18	agla	amylo-alpha-1, 6-glucosidase, 4-alpha-glucanotransferase a	olvlno31_j12	8,254	G	1	1
19	pi4kaa	phosphatidylinositol 4-kinase, catalytic, alpha a	olbrno40_b23	8,168	G	2	4
20	mtor	mechanistic target of rapamycin kinase	oleano11_h24	8,127	G	4	6
21		NIPBL cohesin loading factor	olteno54_m12	8,114	G	2	2
22	col11a2	collagen, type XI, alpha 2	olecno4_f11	8,025	G	3	3
23	tns1a	tensin 1a	olbrno35_b22	7,660	G	3	1
24	cad	carbamoyl-phosphate synthetase 2, aspartate transcarbamylase, and dihydroorotase	olteno15_o22	7,462	G	1	2
25	atg2b	autophagy related 2B	olbrno43_d01	7,422	CGGCCGG CCGATG	1	2
26	ubr4	ubiquitin protein ligase E3 component n-recognin 4	olebno3_b13	7,336	G	2	6
27	dock7	dedicator of cytokinesis 7	olbrno38_a10	7,288	G	1	5
28	myh9	myosin heavy chain 9	olteno61_m22	7,212	g	2	9
29	pcm1	pericentriolar material 1	oleano34_p18	7,146	G	1	1
30	kif26ab	kinesin family member 26Ab	oleano17_k15	7,138	GACAAAG	1	1
31	scrib	scribble planar cell polarity protein	olebno11_c01	7,132	G	2	5
32	nup210	nucleoporin 210	olteno11_h15	7,078	G	1	2
33	snrnp200	small nuclear ribonucleoprotein 200 (U5)	olbrno10_g16	7,070	G	1	4

この表を見ると7kbp以上の完全長cDNAが、33種の遺伝子から50クローン得られており、長鎖cDNAクローンを含む高品質のライブラリーであることがわかります。10kbp以上の超長鎖cDNAも５種6クローン得られています。最長はankyrin 3と類似性を有する12,985bpのクローンであり、我々がヒト網膜由来細胞株から得られた最長クローンDMXL1（12,786bp）より長いです。

完全長率を評価するには、複数クローンが得られている遺伝子について検討する必要があります。表2は、二桁以上の数のクローンが取れた鎖長5kbp以上の遺伝子です。なお、n5’とn3’は元のデータを見直して補正しました。cDNAの完全長率（FL ratio = n5'x100/n3’）は、長鎖であるにもかかわらず、48.0〜82.4％と高い値を示しています。ベクターキャッピング法を用いた場合、mRNAが分解していなければ完全長cDNAだけが得られるので、cDNAの完全長率はmRNAの完全長率と見なすことができます。遺伝子によって完全長率が異なるのは、出発材料となる組織によって、mRNAの分解の程度が異なることが一因と考えられます。

表2 高頻度長鎖完全長cDNAクローンの完全長率
No.	Gene symbol	Definition	Clone name	Length	5'-Insert	n5'	n3'	FL ratio (%)
1	mmyhl2	myosin heavy chain larval type 2	olecno56_a06	5,982	g	48	100	48.0
2	col1a1b	collagen, type I, alpha 1b	olecno20_i08	5,615	G	28	34	82.4
3	c4b	complement 4B (Chido blood group)	olvlno54_p11	5,518	G	17	27	63.0
4	ol-vit1	vitellogenin 1	olvlno60_k14	5,130	G	731	1,343	54.4

以上の結果から、長鎖遺伝子の完全長cDNAが高い割合で含まれていることがわかり、本プロジェクトで作製されたcDNAライブラリーは高品質であると評価できます。

今後、このコレクションの中から興味ある遺伝子を選び研究対象とする場合、複数クローンが得られたものについては、まずインサートのサイズを計測し、異なるサイズのクローンについては選択的スプライシングバリアントの可能性があるので、全長配列を決めることが望まれます。

今回全長配列が決定されたクローンの塩基配列は、DDBJ/EMBL/Genbankデータベースに登録されていますが、NCBIのサイト「Gene」にはAccession numberがまだ未記載です。これまでメダカの完全長cDNAはほとんど取られていないので、今後各遺伝子について、ORFがコードしているタンパク質のアミノ酸配列を含めて、完全長mRNAとして登録されることが望まれます。また、ゲノムの塩基配列にはまだギャップが存在するようなので、最終的な遺伝子座の決定は、完全なゲノム配列が決定されるのを待つ必要がありそうです。