目的

マダニは節足動物の一種であり、ウシやイヌそしてヒトなどの血を吸い、さまざまな病原体を運ぶ媒体となります。畜産業ではマダニによる経済損失が大きく、最近ではヒトでもマダニ媒介感染症が問題となってきています。そこでマダニが関与する病気の予防用ワクチンや殺ダニ剤の開発が望まれています。そのためにはマダニの生物学的・生理学的特徴を知る必要があります。本研究は、吸血時の生理学的プロセスや胚発生の鍵となる分子を同定するために、マダニの臓器別完全長ESTデータベースを構築することを目的としています。

方法

日本に生息する主要マダニであるフタトゲチマダニの5つの臓器（脂肪体、血リンパ、中腸、卵巣、唾液腺）と胚から、ベクターキャッピング法を用いて完全長cDNAライブラリーを作製し、各ライブラリーからランダムに選んだ10,000クローンの5’端部分塩基配列を決定しました。正逆6フレームがコードするアミノ酸配列を用いてblastxによるホモロジー検索を行い、類似性を有するタンパク質を割り出しました。

結果

6つのライブラリーから、それぞれ約8,000クローン、総計47,584クローンのESTを取得しました。全データはExcelファイルの形で、下記サイトからダウンロードできます。フタトゲチマダニのゲノムの塩基配列はすでに中国のグループによって解読され、GenBankに登録されていますが、今回得られたESTを用いたゲノム上へのマッピングは行われていません。

この研究は、帯広畜産大学の藤崎らが中心になって実施された基礎研究推進事業「マダニの生存戦略と原虫媒介のinterfaceに関する分子基盤の解明（2004～2008年度、研究代表者・藤崎幸蔵）」によるものです。その後、帯広畜産大学では「原虫病研究センター」を設置し、マダニバイオバンク整備の一環としてフタトゲチマダニのESTデータベースを公開しています。

評価

新しい生物種のトランスクリプトーム解析を試みる場合、従来法でESTデータを構築するのが一般的でした。著者らがマダニのEST解析を実施しようとした時、ベクターキャッピング法が出現したので、最初から完全長cDNAを取得する方針になったと思われます。単なるデータベース構築が目的ではなく、標的タンパク質の組換え体作製と機能解析が目的であることも完全長cDNAライブラリーを選んだ理由と考えられます。

全データが公開されたので、これに基づいてライブラリーの評価を行ってみます。６つのライブラリーのESTデータリストには、クローンID、類似性を有するタンパク質の名前、5’端の部分塩基配列、cDNAがコードするタンパク質と類似するタンパク質それぞれの類似性を有する部分のアミノ酸配列が記載されています。

塩基配列データ取得率：それぞれのライブラリーからランダムに選んだ10,000クローンのうち、塩基配列を読めたのは、唾液腺が63％と最も低く、他は74％から83％となっています。唾液腺の場合、既知タンパク質と類似性を持たないクローンの塩基配列を見てみると、単一塩基のストレッチが目立ち、塩基配列の品質が良くないものが多いためデータ取得率が低いと考えられます。

5’端に付加した塩基：いずれのライブラリーもGで始まるものが最も多く、唾液腺72.9%、卵巣74.6%、脂肪体75.6%、中腸77.5%、血リンパ78.9%、胚89.5%がGから始まります。また、TnG（TG、TTG、TTTG）から始まるものを含めると、唾液腺77.4%、中腸82.8%、血リンパ84.0%、脂肪体85.8%、卵巣87.3%、胚93.3％となります。いくつかの5’端塩基配列についてフタトゲチマダニのゲノム配列と比較してみると、これらのGやTnGはゲノム配列にはないので、キャップ依存性G付加に由来することがわかります。従って、完全長率もこの程度と見積もることができます。

完全長率：20クローン以上得られている高発現遺伝子について、その5’端塩基配列を見てみるとほとんどがGあるいはTnGで始まっています。塩基配列によるクラスタリングが行われていないので、短鎖クローンは類似性を持たないクローンの中に混じっている可能性もありますが、類似性を持たないクローンの完全長率（Gで始まるクローンの割合）も高いことから、高発現遺伝子の完全長率は100％に近いと考えられます。

長鎖遺伝子の有無：既知タンパク質とアミノ酸配列の類似性が高いタンパク質をコードしているクローンについて、既知タンパク質のmRNAのサイズが7kbp以上のクローンを表1に記載しました。いずれも5’端がGから始まる完全長cDNAクローンです。最初の3つの巨大タンパク質をコードする遺伝子はコンピュータで予測したものなので、遺伝子のサイズやスプライシング部位が正しいかどうかはわかりません。得られたクローンの全長塩基配列を決定して、実際の鎖長とコードしているタンパク質のアミノ酸配列を決定することが望まれます。Vitellogenin-Bの塩基配列は、本報の著者らがDDBJに登録したものです。本ライブラリーから得られたものだとすると、9.6kbpという長鎖の完全長cDNAが中腸から2クローン、脂肪体から2クローン得られていることになります。

完全長率が高いこと並びに長鎖遺伝子の完全長cDNAクローンが含まれていることから、本プロジェクトで作製されたマダニcDNAライブラリーは、高品質であると評価できます。ゲノム配列を決めた中国のグループはゲノム上の遺伝子についてコンピュータによる全長配列予測を行い、その結果をGenBankデータベースに登録していますが、本研究で得られたcDNA配列と比較すると、転写開始点やスプライシングの予測が合っていないものが多く見られます。今後、本プロジェクトの成果を元にして、転写開始点やエクソン-イントロン構造を決定することが望まれます。

インパクト

著者らのグループは、作成した完全長ESTデータベースに基づいて、血液の消化、酸化ストレス、アポトーシス、生殖、生存などに関わるタンパク質をコードする完全長cDNAクローンを同定し、その中の多くについて速やかに組換タンパク質を作製、その生理活性を調べることができました。その結果、表2に示すように2006年から2021年までに41報の論文（ベクターキャッピング法の論文を引用しているのは24報）として結実しています。完全長cDNAであることのメリットを最大限に活用した典型的な例です。ここで特筆すべきは、鎖長が500bp以下の短いもの（Defensin、333bp）から7kbp以上の長いもの（Ribosomal protein S6 kinase、7,483bp）まで、サイズバイアスがかかることなく完全長cDNAクローンが得られていることです。機能未知のものを含め多くの完全長cDNAが得られているので、今後の機能解析が待たれます。