ことの始まり

東工大資源研の鈴木研究室で大学院博士課程の研究を行い、光応答性膜の論文（K76-1）を出すことができました。この膜は光によって膜電位変化を起こす人工膜として世界で初めての例であったので、この分野の研究の先駆けになりましたが、そのまま実用化できるものではありませんでした。実用的な人工膜としては、生物の化学受容器のように、特定物質が結合することによって膜電位が変化する選択的応答性膜が望まれます。当時、鈴木研では固定化酵素膜を用いて基質を検出するバイオセンサーの開発が進められていました。一方、酵素と基質の関係以外に、特異的な生体反応として抗原抗体反応があります。これを利用すれば、抗原や抗体を検出するセンサーができると考えられます。そこで、抗原を固定化した膜を作製し、抗体が結合することによって膜電位が変化するかどうかを検討してみることにしました。

経緯

光応答性膜では、ホスファチジルコリンというリン脂質を固定化したアセチルセルロース膜を担体として用いました。同様の製法で膜を作製できればと考え、リン脂質が抗原となる抗原抗体反応がないか調べたところ、梅毒の血清と反応するカルジオリピン抗原（緒方抗原）が、カルジオリピン、ホスファチジルコリン、コレステロールの複合体であることがわかりました。そこで、カルジオリピン抗原を固定化したアセチルセルロース膜を作製し、抗体を含む血清と反応させた時の膜電位変化の有無を調べてみることにしました。

結果

カルジオリピン抗原固定化膜を梅毒血清や正常血清と反応させたのち、生理食塩水ついで脱イオン水で十分洗浄後、異なる濃度のNaCl水溶液間に設置し膜電位を測定したところ、梅毒血清と反応した時のみ、反応前後で大きな膜電位の変化が認められました。この膜電位変化は、血清との反応時間とともに増大して最後に一定の値になること、血清を希釈すると減少することなどから、膜表面に梅毒血清中の抗体が結合することに起因すると考えられました。そこでこの膜を免疫応答性膜と命名しました。

膜の両側のNaCl濃度を変えて測定した膜電位の解析により、血清反応後の膜電位変化は膜表面の荷電密度の変化による界面電位変化であることが示されました。すなわち、カルジオリピン抗原のリン酸基に由来する負の荷電が、抗体が結合することによって遮蔽されたと考えると説明できます。このことは、酸性領域で膜電位変化が急激に減少することによっても裏付けられました。

本論文を出した後、膜表面にタンパク質が結合した際に生成する膜電位変化のメカニズムを検討することにしました。アセチルセルロース膜に化学修飾によってブロム基、ついでアミノ基、エポキシ基を導入し、これを介して等電点の異なる2種類のタンパク質、卵白アルブミンとリゾチームを共有結合させました。これらの膜の膜電位特性を調べたところ、卵白アルブミン固定化膜は負荷電膜の、リゾチーム固定化膜は正荷電膜の膜電位特性をそれぞれ示すことがわかり、膜表面に結合したタンパク質は膜の荷電密度変化に伴う膜電位変化を誘起することが示されました（K78-1）。

カルジオリピン抗原膜を実際の梅毒センサーに応用する試みも行いました（K77-4）。膜電位の変化は小さいものでしたが、梅毒血清に特異的な変化であることから、梅毒診断用として使える可能性が示されました。免疫応答性膜のもう一つの例は、赤血球膜抗原（血液型物質）と血清中の抗体（アグルチニン）の反応を用いたものです。赤血球膜から抽出した糖脂質（血液型物質）を固定化した膜を用いて、血液型判定を行うことができることを示しました（K80-1）。

免疫応答膜を実際にセンサーとして応用するとなると、①血清に含まれる抗体の量が微量であるため膜電位変化が小さい、②血清中には多く狭雑物が含まれているので、それらがノイズを生成し安定したかつ定量的な電位変化を得ることが困難である、③一度結合した抗体を外して膜を再利用することが困難であるなどの問題点があり、実用化には至らなかったようです。

余談

梅毒診断用センサーの開発で共同研究を行なった長村洋一先生（藤田保健衛生大）は、1978年に渡独しデュッセルドルフに滞在されていました。ちょうどその時、私もフランクフルトにあるマックス・プランク生物物理学研究所に滞在しており、車でケルンやアーヘンの観光に行った時、デュッセルドルフの先生のお宅にお寄りして泊めていただきました。長村先生は、後年、健康食品管理士認定協会（現日本食品安全協会）を立ち上げられ理事長を務められました。また「多幸之介」というペンネームで、食の安全に関する多くの提言を行っておられます。

被引用文献

本論文を引用した論文を下表にまとめ、それぞれの研究対象を備考欄に記載しました。約半数は本や総説であり、本論文は免疫応答性膜の最初の論文として引用されています。なお、鈴木先生と相澤先生による総説は除外してあります。

論文の多くは、電極表面に抗原を固定化して、抗体と反応した際の電極の電位やインピーダンスの変化を捉えるというものです［1、4、9、11、13］。センサーへ応用する場合、膜電位測定よりは電極特性の測定の方が装置の設計の上で容易であると考えたからであると思われます。

抗原固定化膜を用いて2セル間で測定を行なった例としては、チロキシンを含むリン脂質二分子層膜に抗チロキシン抗体を作用させると一過性のイオン電流が流れるという論文がありました［32］。実はすでに同様の研究が行われており、我々が見逃していたことがわかりました。それは、脂質二分子層膜の表面で抗原抗体反応が起こると、膜抵抗が減少するという報告（Castillo et.al., 1966）です。ただ、この研究は物質の検出を目的としたものではないので、我々が命名した免疫応答性膜は、バイオセンサーの分野における初めての概念であるといって良いかと思います。