ことの始まり

ホモ・プロテインcDNAバンクに含まれている新規cDNAクローンがタンパク質をコードしているかどうかを確かめるために、インビトロ転写／翻訳を行い生成物をSDS-PAGEにかけて分子量を測定することにしました。その中のクローンHP00346は、ORFがコードしているタンパク質から予想される約9kDaのバンドの他に約100kDaの位置にもバンドが現れました。これが何であるか気になっていたので、ERATOプロジェクトのテーマの一つとして考えていたところ、研究員の逢坂文男博士が興味を持たれて取り組むことになりました。HP00346がコードしているタンパク質はユビキチンとアミノ酸配列の類似性（59%の同一性）を有しています。逢坂氏は国立遺伝学研究所で分裂酵母のユビキチン結合酵素の研究（Osaka et al., 1997）で学位をとられたので、うってつけのテーマとなりました。

HP00346がコードしているタンパク質は、1993年にKumarらがマウスの脳の発生過程で発現が減少する遺伝子としてクローン化したNEDD8（Neural precursor cell-Expressed Developmentally Down-regulated 8）（Kumar et al., 1993）がコードするタンパク質と1アミノ酸残基しか違わないことから、ヒトNEDD8であることがわかりました。NEDD8の機能に関してはまだ報告がなかったので、その機能解明を目指すことにしました。

経緯

インビトロ翻訳は³⁵S-Metを含むウサギ網状赤血球溶解液で行われたので、翻訳産物は³⁵SでラベルされたNEDD8となります。翻訳産物をSDS-PAGEにかけたところ、DTTを添加しないと約100kDa (p100)のバンドの他に約66kDa (p66)と約30kDa (p30)のバンドが生成しました。このことからp100はNEDD8が共有結合しているタンパク質、そしてp66とp30はNEDD8とS-S結合で結合しているタンパク質であることが示唆されました。

そこで大腸菌で発現したGST融合NEDD8をウサギ網状赤血球溶解液と反応させたのちアフィニティークロマトグラフィーにかけ、GST融合NEDD8と結合したタンパク質を精製しました。得られたタンパク質をリジルエンドペプチダーゼで分解後、ペプチド断片のアミノ酸配列を決定しました。

結果

アフィニティークロマトグラフィーによってGST融合NEDD8と結合する4つのタンパク質（p1, 62kDa; p2, 50kDa; p3, 22kDa; p4, 120kDa）が得られました。これらのタンパク質についてペプチド断片のアミノ酸配列を決定したところ、p1はAPP-BP1、p3はUbc12、p4はカリン4Aであることが示されました。p2のアミノ酸配列決定には至りませんでしたが、APP-BP1はユビキチン活性化酵素E1のN端と高い類似性を示すことから、p2はE1のC端と類似性を有するタンパク質であり、p1とp2のヘテロダイマーがE1として働くという可能性が考えられました。出芽酵母のゲノムデータベースを用い候補遺伝子を探した結果、Uba3がそれに該当する可能性があったので、それぞれに対応するヒト遺伝子を我々のcDNAバンクやATCCから入手したcDNAを用いて組換え体を作製してタンパク質を調製し、それぞれ予想した通りの活性を有することを実証しました。

新しく見出したNEDD8修飾経路はユビキチンや他のユビキチン様タンパク質とは反応せず独立した修飾系であることが示されました。NEDD8化されるカリンは、ユビキチン修飾経路でタンパク質をユビキチン化するE3活性を持つSCF（Skp/Cul/F-box）複合体の構成成分です。カリン4A以外の他のカリン (Cul-1、Cul-2、Cul-3、 Cul-4B、Cul-5)もNEDD8化されることがわかり、NEDD8はカリンの機能制御を行っていることが示唆されました（K99-6 ）。そこでNEDD8修飾経路の生物学的役割を調べるために分裂酵母からNEDD8修飾経路に対応する遺伝子を同定しました。この経路を解析した結果、SCFのNEDD8化によってCDKインヒビターRum1のユビキチン化と分解が起こることから、NEDD8化が細胞周期の制御に関与していることが明らかになりました（K00-1）。

余談

精製タンパク質のアミノ酸配列決定には、プロテアソーム研究の第一人者であられる都臨床研の田中啓二博士の助けをお借りしました。逢坂氏は徳島大学の学生時代に田中氏のラボでDNA取扱技術を習得されたと伺っており、ご縁に驚きました。なお、田中啓二氏とは過去にプロテアソーム構成成分のcDNAクローニングで共同研究を実施し2報の論文を出しています（K96-3、K98-5）。

当時、他の研究グループもNEDD8経路解明に向けた研究を実施していたようです。テキサス大学のKamitaniらはヒトNEDD8が心臓と骨格筋で高発現していること、COS7細胞で発現させるとモノマー以外に90kDaのバンドが見られることを明らかにしました（Kamitani et al., 1997）。この90kDaのバンドの正体を突き止めようとしていたと思われますが、我々が先にカリンであることを明らかにすることができました。インビトロ翻訳を用いるという我々の作戦がうまくいったのは、ウサギ網状赤血球溶解液の中にNEDD8修飾経路に関与しているタンパク質と標的タンパク質が含まれていたことによります。

被引用文献

Google Scholarで検索した結果、被引用数は現時点（2024年）で310となっています。ただ、この中には本や博士論文も含まれています。Dimensionsによれば被引用数は233です。その中から総説のみを選び48報を下表に示します。その中で次の4報がオープンアクセスでありかつ引用文件数と被引用数が多く、NEDD8修飾経路やその役割に関する最新情報を得るのに役立ちます。

我々とほぼ同時に出芽酵母のRUB1修飾経路が報告され（Liakopoulos et al., 1998）、これがNEDD8修飾経路に対応することがわかりました。したがって、NEDD8に関する下記の総説では、我々とLiakopoulosの論文がNEDD8修飾経路を発見した論文として引用されています。

RabutとPeterはNEDD8化経路、NEDD8化の標的となるタンパク質とNEDD8化の効果について2008年までの成果をまとめています［19］。LydeardらはNEDD8化の標的タンパク質であるカリンを含む複合体Cullin-RING E3 ubiquitin ligase (CRL)の構造、NEDD8化によるCRLの構造変化と活性化機構、Cullin-COP9 signalosomeによる脱NEDD8化、CRLに結合するCAND1の役割について2013年までの知見をまとめて解説しています［28］。HarperとSchulmanはCRL制御系の分子機構について2021年までの知見をまとめて解説しています［42］。2024年にZhangらはNEDD8化によるCRLの制御に関する最新情報に加え、カリン以外のタンパク質のNEDD8化とその役割、NEDD8化の制御不全と病気との関連、NEDD8化阻害物質の治療薬としての可能性などについて、536報という膨大な数の文献を引用して解説しています［47］。

NEDD8化と疾患との関連については、神経変性疾患［24］、アルツハイマー病［25、32］、癌［26、34、36、38、45、48］、心血管疾患［43］についての総説が見られます。特に興味深いのはアルツハイマー病との関連です。NEDD8を活性化するE1の構成成分として同定されたAPP-BP1がアミロイド前駆体タンパク質（APP）と結合するタンパク質であることやAPP自身もNEDD8化を受けることなどから、アルツハイマー病と何らかの関連がある可能性が考えられています。