ことの始まり

相模中研において、ホモ・プロテインcDNAバンク構想に基づき、cDNAライブラリーから無作為に取り出したcDNAクローンの部分塩基配列決定を開始しました。得られたcDNAクローンがコードするタンパク質の部分アミノ酸配列で、タンパク質のアミノ酸配列データベースを検索し、既知タンパク質と類似性を有するものを高頻度で見つけることができました。その中から生体機能において重要な働きを持っていると考えられるものを選び、順次全長塩基配列決定、タンパク質の調製、活性測定を実施し、論文化を進めることにしました。

経緯

ヒト組織球性リンパ腫細胞株U937をフォルボールエステルPMAで刺激すると各種サイトカインを分泌することが知られていたので、この細胞株から種々の方法でcDNAライブラリー作製を試みて来ました。その一環でPruitt法により作製したcDNAライブラリーの部分塩基配列を決定したところ、土壌微生物シュードモナス・プチダのグリオキサラーゼ I とアミノ酸配列が類似性を有するcDNAクローンを見出しました。

結果

得られた4個のcDNAクローンのうち、2.2kbpと1kbpの2個は、全長塩基配列決定とノザンブロットの結果から完全長cDNAクローンであることが示されました。短い方は選択的ポリ(A)付加によるものです。ORFは184アミノ酸残基のタンパク質をコードしており、すでに報告されていたヒト赤血球から精製されたグリオキサラーゼ I (GLO1）のアミノ酸組成と一致しました。さらに、cDNAの大腸菌による発現産物は、メチルグリオキサールを分解するGLO1活性を有していました。以上の結果から、得られたcDNAはヒトGLO1をコードしていることが確かめられました。SDS-PAGEで大腸菌による発現産物のバンドは低収量のため見られませんでしたが、ネイティブPAGEによる活性染色法ではバンドが見られました。

余談

このcDNAクローンは、相模中研に東海大から卒研生として来ていた大村悟君が、U937cDNAライブラリーの部分塩基配列解析を行なっている時見つけました。このように卒研生でも論文の著者になれるというので、卒研生にとっても大いに実験のモチベーションが上がりました。他の卒研生たちもそれぞれ面白いタンパク質をコードしているcDNAを見つけているのですが、活性測定法がないため論文化には至りませんでした。そのような場合、類似性を有しているタンパク質を研究し、活性測定法を有している研究者と共同研究するのが最も手っ取り早いということで、以後その方針で研究を進めることになりました。

驚いたことに、2ヶ月前に同じ雑誌J. Biol. Chem.にヒトGLO1のcDNAに関する論文（Ranganathan et al., 1993）がすでに載っていたのです。米国のFox Chase Cancer CenterのTewのグループで、ヒト結腸組織から単離精製したGLO1に対するポリクロナール抗体（Ranganathan et al., 1993）で、市販のヒト結腸cDNAのλgt11ライブラリーをスクリーニングし、GLO1のORFを含む短縮cDNAを得ています。投稿を受け付けた日付は、我々の論文が1993年9月22日、彼らの論文は1993年10月23日と我々の方が1ヶ月早いですが、我々の方が改稿を求められたためか発行日が2ヶ月遅くなりました。彼らはタンパク質の精製、抗体作製、スクリーニングと多くの時間と労力をかけているので、偶然cDNAが取れた我々とほぼ同時の発表になるのはちょっと申し訳ない気がしました。我々の方法が発現量の多いハウスキーピングタンパク質のcDNAを得るのに極めて有効であることを示す例となりました。

今回得られたcDNAクローンがGLO1であると推測したのは、コードしているタンパク質のアミノ酸配列がシュードモナス・プチダのグリオキサラーゼ I の配列 (Rhee et al, 1988)と類似性を有していたからです。ところが、類似性があるのはC端側3分の2の領域であり、N端側に類似性はありませんでした。この点について疑問に思っていたところ、シュードモナス・プチダのグリオキサラーゼ I のcDNAのクローニングに関する新しい論文が現れ、全領域にわたって類似性を有することが示されました（Lu et al., 1994；被引用文献No.2）。すなわち、Rheeらのグリオキサラーゼ I のN端側の配列に誤りがあったわけです。

被引用文献

Google Scholarで検索した結果、被引用数は現時点（2024年）で46となっています。本論文はヒトGLO1のcDNAをクローニングした最初の論文として、Ranganathan et al.の論文（Ranganathan et al., 1993）と一緒に並べて引用されています。その多くは、種々の生物由来のグリオキサラーゼ I のcDNAをクローニングし、アミノ酸配列の比較をする参照配列としての引用です［8, 11, 15, 17, 19, 20, 21, 23, 24, 27, 31, 39, 40, 43, 46 ］。

ヒトGLO1の研究はウプサラ大のMannevikらのグループによって、赤血球から単離精製したGLO1を用いて精力的に実施されてきました。しかし、当時彼らはcDNAクローン化の試みは行わなかったようです。その後、彼らは我々の配列情報を基にしてHeLa細胞のcDNAライブラリーからPCRでGLO1のcDNAを取得し、大腸菌による大量発現を行いました［10］。さらに得られた組換え体を用いて結晶構造を解析したり［12］、点変異体を作製し反応機構の解明を行っています［14, 18］。なお、ウプサラ大で取られたcDNAは、我々のcDNAと一箇所塩基配列に違い（C>A）があり、111番目のアミノ酸残基がAlaからGluに変わるアイソフォームをコードしていました。同時期、我々もヒト繊維芽腫細胞株HT-1080のcDNAライブラリーから、Ala型とGlu型の2種類のアイソフォームcDNAをクローン化して論文化しました（K95-1）。

他に、様々な生物のプロテオーム解析の際、主要な成分の一つとしてグリオキサラーゼ I が含まれるという論文での引用が目立ちます［22, 26, 28, 30, 33, 38］。また、グリオキサラーゼ IIに関する論文で、グリオキサラーゼ I について触れる場合に引用されることもあります［9, 13, 32, 35］。

その後、GLO1の生理機能と病気との関係に関する研究が進展しているので、その内容についてはヒト遺伝子コレクション - グリオキサラーゼ I のページで紹介しています。