ことの始まり

2001年に国立障害者リハビリテーションセンター研究所に赴任することになり、主要テーマとして網膜色素変性症の原因遺伝子探索を掲げることにしました。目標の一つは、これまであまり解析が進んでいなかった網膜色素上皮細胞 (retinal pigment epithelium, RPE)で発現している遺伝子を網羅的に解析し、RPE特異的な遺伝子を見つけ、網膜色素変性症の新規原因遺伝子候補とすることです。

そこで、ヒト網膜色素上皮細胞の細胞株であるARPE-19から完全長cDNAライブラリーを作製し、その中からRPE特異的な遺伝子を見つけることを計画しました。KASTのプロジェクトで開発した「キメラオリゴキャッピング法」を用いてcDNAライブラリーの作製を試みましたが、なかなかうまく行きません。やはり、場所が変わり、人が変わリ、水が変わると、プロトコル通りにやってもうまくいくとは限らないということを思い知らされました。

そんな折、塩基配列解析受託事業を大規模に展開していた日立計測器サービス（株）から、完全長cDNAライブラリーの作製を事業化したいので、共同研究を行えないかという打診がありました。研究員も派遣してくれるということなので、共同研究を実施することになりました。

経緯

最初にキメラオリゴキャッピング法の改良を試みることにしました。キメラオリゴキャッピング法の最大の難点は、工程数が多いことです（全7工程）。特に、mRNAを処理するする工程が、バクテリア由来アルカリホスファターゼ (BAP) 反応、タバコ酸性ピロホスファターゼ (TAP) 反応、キメラオリゴヌクレオチド連結反応と３工程あり、これらの工程でmRNAが分解することが、完全長率低下の主な原因と推察されました。

そこで考えたのは、mRNAの分解を防ぐために、先にベクタープライマーとmRNAをアニールし、逆転写酵素 (RTase) で第一鎖cDNAを合成した後、BAP処理、TAP処理、キメラオリゴヌクレオチド連結反応を行ったらどうかということです。mRNA:cDNAヘテロ二重鎖のmRNAからTAPによってキャップが外れ、そこにT4 RNAリガーゼによってキメラオリゴヌクレオチドが連結するという保証はありませんが、試してみる価値はあると思いました。しかし、生成物を調べてみると、キメラオリゴヌクレオチドが連結したものは得られず、なぜかcDNAの５’端が直接ベクターに結合しているものが得られました。しかも、含有量の多いリボソームタンパク質の完全長cDNAの５’端に余分なGが1個ついていることに気がつきました。この余分なGがRTaseのキャップ依存性塩基付加に起因することを、本論文を出す前に、別の論文で明らかにしました（K04-1）。

なお、リボソームタンパク質の完全長cDNAが、CTTTTTから始まることは、以前報告しており（K94-4）、もし他の遺伝子であったならば、Gの付加に気付かなかったかもしれません。この時たまたま取れたクローンがリボソームタンパク質cDNAであったこと、しかもリボソームタンパク質のmRNAはCから始まることを知っていたことが幸いしました。

その後、条件をさまざま変えて実験を行ったところ、BAP処理とTAP処理は不要であり、T4 RNAリガーゼさえあれば良いということがわかりました。すなわち、下図に示すたった3工程で完全長cDNAを合成できるということです。さらに特筆すべきは、精製したmRNAの代わりに数μgの総RNAを用いた方が良質のライブラリーができるという点です。そこで、ヒト培養細胞株であるARPE-19と生体組織の例としてマウス肝臓からcDNAライブラリーを作製し、それぞれのライブラリーから任意に選んだ4,800個と1,152個のcDNAクローンについて、5’端の部分塩基配列を決定してみました。

結果

結果は驚くべきものでした。ARPE-19細胞株のcDNAライブラリーにもっとも多く含まれていたのはグリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ (GAPDH) cDNAですが、得られた55個すべてが完全長であり、短縮クローンは含まれていません。すなわちこの遺伝子に関しては完全長率100％です。5箇所の転写開始点から始まり、いずれも5’端にゲノムの配列にはないGが存在します。1個のG付加が最も多く、他にGG、AG、TG、TGGなどの付加が見られます。

20個以上取れた14種の遺伝子をコードするcDNAクローン計455個のうち、447個 (98.2％) が完全長であり、短縮クローンはわずか8個でした。完全長クローンのうち429個 (96%) が、GやNGから始まっています。サイズが2.5kb以上の遺伝子では、複数個（4〜18個）取れているものが15種類、計93クローン見つかりました。そのうち完全長は89個（95.7%）と若干完全長率は低下しました。

注目すべきは、7kbp以上の長鎖cDNAクローンが8個得られていることです。いずれも、5’端はゲノム配列にないGから始まっています。さらに全長配列を決定したところ、3’端にポリAテールがついており完全長であることを確認しました。最も長い9,405bpのクローンは、フィラミンBをコードしています。7,319bpのアグリンをコードするクローンは、現時点でもGenBankに登録されている唯一のアグリン完全長cDNAです。短縮クローンは、アグリンにのみ1個見られました。

生体組織から抽出したものでも、高い完全長率が得られるかどうかを確かめるために、マウスの肝臓から抽出した総RNAを用いてライブラリーを作製してみました。最も多く含まれている主要尿タンパク質1 (Mup1) の完全長率は98.6% (69/70)、8個以上含まれている13種類の遺伝子の完全長率は98.4％ (246/250) と培養細胞と同様の高い値を示しました。

cDNAの長さに関わらず完全長率が高い最大の原因は、精製mRNAではなく総RNAを用いて第一鎖cDNAを合成したことにあると考えています。ベクターキャッピング法はキャップトラッパー法のようにキャップを有するmRNA:cDNAヘテロ二重鎖を選別する方法ではないので、分解したmRNAからは短縮cDNAしかできないはずです。それにもかかわらず、これだけ完全長率が高いということは、mRNAはほとんど分解していなかったことを意味しています。これまでは主にmRNAを処理する工程で分解が起こると考えていましたが、実際は総RNAからmRNAを精製する工程でもかなり分解が起こっていたのではないかと推測されます。

mRNAが分解している場合には、本法を用いても完全長率の高いライブラリーを作製することはできませんが、cDNAの5’端にゲノム配列にないGがあるかないかで、完全長かどうかの判定はできます。どうしても高品質のRNAを調製できない場合でも、完全長率の低いライブラリーの中から、5’端の配列を見ることによって完全長クローンをある程度識別できることになります。ゲノム配列にないGから始まる場合は、完全長と考えて良いですが、ゲノム配列にあるGから始まる場合は、判定不能となります。

マイナーな発見は、遺伝子によってはGから始まらない完全長cDNAもあるということです。これはキャップがついていないmRNAに由来すると思われますが、生理学的に何を意味するかは今後の検討課題です。

余談

本研究は日立計測器サービス（株）との共同研究の成果なので、論文投稿より先に特許出願を行いました。完全長率の高さから、日立の担当者の皆さん方は十分事業化できると判断され、論文投稿前から大々的に宣伝活動を開始されました。すぐに多くの引き合いがあり、満足いく結果が得られているという報告を受けました。そこで、我々も早く論文化する必要に迫られました。

当時創刊されたばかりの「Nature Methods」と、この分野では権威のある「Genome Reserch」に投稿しましたが、門前払いを食いました。画期的な結果なのに、あまりに単純な方法なので、編集者にとって魅力的に思えなかったのでしょう。”Simple is best”を強調すべきであったかもしれません。査読にまわされれば、確実に受理されたと思うのですが。日立の顧客の中から方法に関する論文を引用しなければならないという催促話が複数出てきたので、かずさDNA研究所の大石道夫博士が編集長を務めておられた「DNA Reserch」に投稿し、掲載していただきました。

完全長cDNAクローンが全てGから始まるので、最初、論文のタイトルを”G-capping”としました。ところが、査読者から、Gは結果的に付加したものなので、適切な命名ではないのではというご指摘をいただき、”Vector-capping”に変更しました。略して”V-capping”、査読者曰く「VictoryのVですね」。

海外でこの論文の重要性にいち早く気付いたのが、フランスのcDNAプロジェクトのリーダーであったAuffrayです。F1000にMust Read論文として、推薦してくれました。

なお、本研究の成果は、流動研究員であった大床国世博士並びに日立から派遣されてきた木村知子氏と議論を重ね、多くの条件検討の結果生み出されたものです。すなわち、大床氏や木村氏との出会いによって生み出された成果です。特に、本法の成否の鍵を握るのは、高品質のベクタープライマーですが、お二人の熟練した技術によって作製されたものです。

疑問点

本法の最大の特徴は、数μgの総RNAから、たった3工程で今までにない高品質の完全長cDNAライブラリーを作製できることです。その理由については、次の論文（K08-1）で考察したようにほぼ説明がつきますが、残された最大の謎は、mRNA:cDNAヘテロ二重鎖の末端とベクターの平滑末端がどのようにしてT4 RNAリガーゼによって連結されるのかということです。他にもいくつか疑問点がありますが、これらについても別項で考察します。

被引用文献

「DNA Research」のMetricsには、2017年以降のデータしか記載がありませんが、PDFダウンロード数は2021年10月時点で403と、発表から10年以上経過しているにも関わらずコンスタントに見られているようです。被引用数は、Google Scholarで検索した結果、現時点で92となっています。

被引用文献（特許を含む）について、年代順に国、研究機関、雑誌名、論文タイトルをリストにまとめてみました。その内訳を見ると、大きく二つに分かれます。一つは、完全長cDNAライブラリーの作製法の一つとして紹介したもの、もう一つは、実際にこの方法で種々の生物から完全長cDNAライブラリーを作製して解析したものです。なお、PubMedでカバーしていない雑誌もあるので、PMIDのない文献があります。それらについては、論文内容が見られるURLを記載してあります。

完全長cDNAライブラリーを作製する方法論の一つとして引用されたものは、トランスクリプトームの解析（R06189a, R08164, R08187, R13053a）、転写開始点の同定法（R07157, R08164, R09114）、上流オープンリーディングフレーム（uORF）の同定法（R06079）です。

ベクターキャッピング法を用いて完全長cDNAライブラリーを作製した論文については、備考欄に材料RNAを抽出した生物の名前を記載してあります。下記にまとめたように、30種類の生物からライブラリーが作製され、発現遺伝子の解析が行われています。赤字で記載した生物に関する論文は全発現遺伝子を対象とするトランスクリプトーム解析であり、それ以外の論文は特定遺伝子の完全長cDNAクローニングを目的としたものです。個々の論文の詳細については、開発者の視点から別項で考察します。

我々の論文が出る前に出版されたため、引用が間に合わなかった論文もあります （R05196、R05206）。また、ベクターキャッピング法の論文として、誤ってキャップ依存性dG付加の論文（K04-1）を引用した論文があります（R08191, R10109, R11073a, R13050）。誤引用の最大の原因は、ベクターキャッピング法の論文を最初に引用した三浦らの論文（R06104）で、キャップ依存性dG付加の論文とベクターキャッピング法の論文を並べて引用したことにあると思われます。しかし、論文のタイトルを見れば簡単に区別できるはずであり、多くの著者が引用文献をきちんと読まずに引用していることを示唆しています。

論文が出る前、日立は「G-キャッピング法」という名前で宣伝していましたが、論文が出てから「V-キャッピング法」と名前を変更したため、被引用論文の中には、同じ方法であることに気づかずに、二つの方法が異なる方法であるかのように記載しているケースがあります（R13014：Table 1）。

ベクターキャッピング法を用いているのに、我々の論文を引用していない被引用文献もあります（R10107、R12067）。これらは、”vector-capping”で検索することによって見つけることができました。他にもベクターキャッピング法を用いてライブラリーを作製したという報告書類がいくつかヒットしてきますが、論文作成にまでは至っていないようです。