ことの始まり

相模中研とスポンサー会社5社の共同プロジェクトであるGE研究室が終了し、その後継となる研究テーマとして、私が提案したのが「ホモ・プロテインcDNAバンク構想」です。これはヒト有用タンパク質を探索するために、遺伝子の方から攻めようという計画です。そのために必要な技術開発を行うプロジェクトが、（財）神奈川科学技術アカデミー（KAST）で「ヒューマン・プロテインプロジェクト」として採択されました。その主要成果である新規完全長cDNAライブラリー作製法を用いてホモ・プロテインcDNAバンクのプロトタイプを構築したのが本論文です。

タンパク質をターゲットにするのであれば、完全長cDNAの取得が必須となります。さらに、取得したcDNAの塩基配列決定を容易に行えることや、cDNAがコードするタンパク質の機能解析のためのインビトロ発現や哺乳動物細胞内発現を他のベクターに組み換えることなく行えるシステムが望まれます。そこでこれらを満足するcDNAライブラリー作製法の開発と解析システムの構築を目指しました。

経緯

当時完全長cDNAライブラリー作製法として知られていたOkayama-Berg法は、NIHに出張中に試してみましたが、なかなかうまくいきませんでした。その後、Okayama-Berg法の改良版として報告されたPruitt法を用いることにより、ある程度満足できるライブラリーを作製することができました。ただ、分解したmRNAに由来する短縮cDNAも含まれており、得られたcDNAが完全長かどうかの判定ができないという問題がありました。

この問題を解決する方法として開発したのが、キメラオリゴキャッピング法です。その開発の経緯とcDNA合成工程は、先行論文であるNucleic Acids Symp Ser. （K93-4）の論文紹介に記載してあります。本論文では、クローン化したcDNAの塩基配列決定と哺乳動物細胞内発現やインビトロ発現を可能とする多機能ベクターpKA1を作製し、これをベクタープライマーとして用いてライブラリーを作製しました。そして、作製したライブラリーに含まれるcDNAクローンの5’端部分塩基配列解析を試みることにしました。

結果

ヒト組織球リンパ腫細胞株U937のポリ(A)^＋RNAからPruitt法で、またヒト繊維肉腫細胞株HT-1080のポリ(A)^＋RNAからキメラオリゴキャッピング法でライブラリーを作製し、それぞれのライブラリーから無作為に選んだ776クローンと720クローンの5’端部分塩基配列を決定しました。その結果、既知タンパク質と同じあるいは類似性を有するタンパク質のMetから始まる翻訳領域を有するcDNAが、236種類、683個得られました。

この中には70種類のリボソームタンパク質cDNAが含まれており、23種はヒトリボソームタンパク質の新規cDNAでした。他にも多くのハウスキーピングタンパク質をコードするcDNAが含まれており、完全長cDNAライブラリーからランダムに選んだクローンの5’端部分塩基配列解析が、完全なタンパク質をコードするcDNAを効率的に取得する有効な方法であることが示されました。

5’端部分塩基配列解析の結果を見て驚きだったのは、得られたすべてのリボソームタンパク質をコードするcDNAの5’端にCmTnC（m=0, 1, 2; n≧1）というピリミジンに富む配列（5’TOP, 5’ terminal oligopyrimidine）が存在したことです。他にもEF-1α、laminin-binding proteinなど、同様の配列で始まるcDNAが見つかりました。不思議なのは、同じタンパク質のcDNAであっても、ゲノムの配列にはない、Cの数（m）やTの数（n）が異なる多型が見られることです。

キメラオリゴキャッピング法は、原理的にはキャップ部位から始まる完全長cDNAのみを生成するはずですが、実際は分解したmRNAに由来する短縮cDNAクローンも一定割合で含まれていました。5’端が同じ配列である複数のクローンが取れている場合は完全長と判定できますが、1クローンしか取れていない場合、たとえMetから始まるタンパク質をコードしていても完全長cDNAかどうか判定不能であり、今後の課題として残りました。

余談

多機能ベクターの名前”pKA1（ピカイチ）”は、私の名前のイニシャル”K”と、プラスミドを作製してくれた青木隆史氏のイニシャル”A”に由来します。その後、このベクターを改良したものの名前を、pKA2、pKA3とするわけにはいかず、pKA1U、pKA1Mなどとしています。ある会合で東大医科研の新井賢一博士から、自分もpKA1というベクターを作ったことがあるよと言われました。確かに新井氏のイニシャルは、K. A. です。

本論文はヒト完全長cDNAバンクの構築を提唱する初めての論文として、最初Natureへ、ついでNature Geneticsへ投稿しましたが、いずれも拒絶されました。当時、ヒト遺伝子特許出願で、我々の技術がNatureのNewsに取り上げられたりしており、査読者の中にこの論文が出ることを好ましくないと思っている人がいたようにも思えます。結局Geneに投稿して受理されました。

疑問点

被引用文献

2014年までの20年間で、84件の引用がなされています。最も多いのは、完全長cDNAライブラリー作製法の一つとしての引用で、丸山＆菅野のオリゴキャッピング法の論文（Maruyama and Sugano, 1994）と一緒に引用されています。次に多いのは、特定遺伝子のcDNAの配列情報に関する引用で、24件あります。その中の半分12件は、5’TOPに関するものです。いくつかのリボソームタンパク質のmRNAの5’端に5’TOPが存在することはすでに報告されていましたが、それ以外の多くのタンパク質mRNAでも5’TOPが存在することを明らかにした最初の論文であるためと思われます。取得した完全長cDNAを用いて、塩基配列解析や機能解析を行なった論文も14件ありますが、これらは全て我々が直接関与した論文です。